長讀長單細胞RNA異構(gòu)體測序（scISO-Seq）可以揭示單個細胞中的轉(zhuǎn)錄本剪接等結(jié)構(gòu)變異研究，但仍存在測序通量低、研究成本高等瓶頸，且轉(zhuǎn)錄本測序深度覆蓋度低，分析結(jié)果相對不準(zhǔn)確。
5月6日，華大基因（300676）唐沖博士團隊和中山大學(xué)眼科中心眼科國家重點實驗室劉奕志院長團隊共同在Nature Communications（影響因子：17.694）發(fā)表名為“High-throughput and high-accuracy single-cell RNA isoform analysis using PacBio circular consensus sequencing”的文章（點擊文末“閱讀原文”查看文獻）。
該研究突破關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，開發(fā)了HIT-scISOseq技術(shù)，將單細胞多個cDNA串聯(lián)建庫，結(jié)合PacBio平臺（CCS）測序，以實現(xiàn)高通量和高精度的單細胞RNA亞型測序研究。
(資料圖片僅供參考)
HIT-scISOseq可以助力單個PacBio Sequel II SMRT Cell產(chǎn)出8M數(shù)據(jù)量，獲得大于1,000萬條的高精度全長轉(zhuǎn)錄組有效reads，同時利用新開發(fā)scISA-Tools分析工具，將HIT-scISOseq多倍通量串聯(lián)測序片段用為單細胞cDNA分析，準(zhǔn)確度和特異性大于99.99%。
此項研究中應(yīng)用HIT-scISOseq技術(shù)解析表征3,375個角膜緣細胞的轉(zhuǎn)錄組，揭示其中的細胞類型特異性異構(gòu)體表達。
關(guān)鍵技術(shù)路線
采用高通量單細胞分選技術(shù)，獲得單細胞全長cDNA序列，利用生物素化的PCR引物對全長cDNA進行擴增，然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴增的生物素化的cDNA（圖1），并使用USER酶在cDNA的兩個末端產(chǎn)生粘性末端，進一步使用DNA連接酶連接多個cDNA構(gòu)建CCS文庫后進行長讀長測序。
圖1 HIT-scISOseq單細胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的技術(shù)流程
重要研究成果
●有效數(shù)據(jù)獲得率高
采用相同的樣本進行不同技術(shù)測評顯示結(jié)果如下：
1. HIT-scISOseq cDNA特有捕獲技術(shù)，可將無效TSO artifact reads從50%降低到8%（圖2b）；
2. HIT-scISOseq有效比對reads數(shù)是常規(guī)單細胞全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的平均8.3倍（圖2c）；
3. HITscISOseq得到的單個細胞基因數(shù)（或單個細胞UMI數(shù)）要明顯高于常規(guī)單細胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖2g）。
圖2 HIT-scISOseq單細胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)性能概述
●細胞類群分析結(jié)果與短讀長一致
1. 為了驗證HIT-scISOseq區(qū)分不同細胞類型的能力，研究者比較了HIT-scISOseq和RNA短讀長測序在相同的高通量單細胞平臺獲得的角膜緣上皮細胞cDNA樣本上，HIT-scISOseq和短讀長測序平臺之間的cell標(biāo)簽的UMI計數(shù)（Pearson系數(shù)r=0.992）和基因的UMI計數(shù)（Pearson系數(shù)r=0.956）之間存在很強的相關(guān)性（圖3a，b）；
2.生物學(xué)重復(fù)樣本間采用HIT-scISOseq技術(shù)獲得單細胞UMI計數(shù)也具有較高一致性（Pearson系數(shù)r=0.998）（圖3c）；
3.相同樣本在不同測序長度下，細胞聚類結(jié)果類型及邊界基本一致（圖3d，e）；
4.細胞條形碼計數(shù)的高度一致性，表明HIT-scISOseq 可以可靠地分析高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組（圖3f）；
5.每個細胞類群前15個標(biāo)記基因的表達并在兩個平臺之間發(fā)現(xiàn)了相似的表達模式（圖3h，i）。
這些結(jié)果證實，基于HIT-scISOseq的單細胞基因表達譜分析結(jié)果與基于短讀長測序的方法的結(jié)果相當(dāng)。
圖3 HIT-scISOseq單細胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行單細胞基因表達分析
●單細胞轉(zhuǎn)錄本亞型豐度與已知成分高度一致
為了驗證HIT-scISOseq可以準(zhǔn)確量化亞型表達，首先使用SIRV來演示亞型檢測。
1. 使用HIT-scISOseq SIRV同種型數(shù)據(jù)，顯示混淆率低至0.1066%（1-TPR，圖4b）；
2. 通過將HITscISOseq獲得的觀察值與已知的ERCC異構(gòu)體豐度數(shù)據(jù)進行比較來評估異構(gòu)體量化結(jié)果：HIT-scISOseq測得的豐度與已知成分高度一致，相關(guān)系數(shù)為0.97（圖4a）。
圖4 HIT-scISOseq單細胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行單細胞異構(gòu)體水平表達分析
●在識別和量化單細胞亞型方面的能力強
1. 研究者從樣本s1和s2中保留了單細胞水平29,392和31,793個異構(gòu)體亞型，其中FSM（完全剪接匹配：與參考注釋匹配的異構(gòu)體）是兩個樣本中最豐富的亞型，并且有相當(dāng)數(shù)量的NNC亞型（已有結(jié)果至少一個未注釋：包含至少一個未注釋的剪接位點的同種型），表明HIT-scISOseq可用于改進參考單細胞轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體注釋（圖4c）。基于亞型水平的表達，我們觀察到同一個細胞聚類模式如上述基因水平分析（圖4d）；
2. 進一步分析了每個細胞簇的前15個標(biāo)記亞型，發(fā)現(xiàn)其中一些亞型以前未被識別（圖4e）。在每種細胞類型中選擇了2個標(biāo)記亞型用于表達模式驗證，并且結(jié)果顯示這些標(biāo)記亞型確實呈現(xiàn)細胞類型特異性表達（圖4f，g），證明HIT-scISOseq是能夠有效解析單細胞亞型表達。
總 結(jié)
HIT-scISOseq是一種高通量、高精度、技術(shù)上可行的方法，可以加速長讀長單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)新興領(lǐng)域的發(fā)展，極大的推動高通量單細胞長讀長測序成本的降低。
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責(zé)任編輯：Rex_10
